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單細(xì)胞入門-讀一篇scRNA-seq綜述講解：

　　1.1. 實(shí)驗(yàn)

　　簡(jiǎn)單回顧測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，從桑格爾發(fā)明雙脫氧末端終止法(一代測(cè)序)到人類基因組計(jì)劃歷時(shí)13年耗費(fèi)30億美元，測(cè)序一直很貴，直到高通量的邊合成邊測(cè)序技術(shù)(二代測(cè)序)出現(xiàn)。隨著測(cè)序價(jià)格的不斷下降，2009年開(kāi)發(fā)出了第一個(gè)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法(湯富酬)。

　　經(jīng)過(guò)8年多時(shí)間的發(fā)展，如今不同的scRNA-seq流程有了大量改進(jìn)，它們一般都分為四步：

　　1. 單細(xì)胞(核)的分離和裂解

　　2. 反轉(zhuǎn)錄

　　3. cDNA擴(kuò)增

　　4. 測(cè)序文庫(kù)制備

　　1.1.1. 單細(xì)胞分離的步驟至關(guān)重要

　　除游離細(xì)胞外的細(xì)胞分離，有兩條路線：

　　i. 組織切片 - 激光捕獲顯微切割(LCM)或者膜片鉗(Patch clamp)

　　ii. 酶法去除細(xì)胞間質(zhì) - 各種微操技術(shù)分選出單個(gè)細(xì)胞(各有優(yōu)劣)

　　微吸(Micro-pipetting)適用于細(xì)胞量少或比較珍貴的樣品，精準(zhǔn)可見(jiàn)，通量低。

　　流式細(xì)胞分選(FACS)和微流控(Microfluidic)設(shè)備適用大量可用細(xì)胞，通量高。

　　· FACS同樣用于篩選特定標(biāo)記的某類細(xì)胞，它可能分出不止一個(gè)細(xì)胞和造成細(xì)胞損傷。

　　· 微流控更加溫和，用于高度標(biāo)準(zhǔn)化的自動(dòng)化流程，缺點(diǎn)是假定細(xì)胞損失和細(xì)胞大小偏好，目前的商用設(shè)備包括10X Genomics的Fluidigm C1系統(tǒng)和Illumina的Biorad SureCell系統(tǒng)(含ddSEQ細(xì)胞隔離器)。

　　微管平臺(tái)(Microwell platforms)能夠消除細(xì)胞大小偏好，也可以通過(guò)顯微觀察排除分出多個(gè)細(xì)胞的情況，商用設(shè)備有WaferGen的ICELL8單細(xì)胞系統(tǒng)。

　　多數(shù)單細(xì)胞收集方法都要求樣品是完好的新鮮組織，因?yàn)槲h(huán)境的改變影響正常細(xì)胞過(guò)程;酶促反應(yīng)也可能使細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激，從而改變基因表達(dá)。有一個(gè)辦法來(lái)避免這些問(wèn)題，那就是只收集細(xì)胞核，細(xì)胞核包含未加工的mRNA和很少的mRNA。細(xì)胞核很黏，目前只有FACS能做到這一點(diǎn)。

　　1.1.2. 反轉(zhuǎn)錄

　　大部分公開(kāi)的流程都是使用oligodT引物，可以捕獲到具有多聚結(jié)構(gòu)的mRNA和少部分lncRNA。

　　SUPeR-seq使用了混合oligodT和六堿基隨機(jī)引物的方法，然而它沒(méi)有去除rRNA卻只檢測(cè)到很少的rRNA，猜測(cè)是沒(méi)有把二級(jí)結(jié)構(gòu)打開(kāi)。

　　MATQ-seq最近被報(bào)道比Smart-seq2更靈敏，產(chǎn)量更高。它是基于MALBAC引物設(shè)計(jì)的，能做到全基因覆蓋，檢測(cè)總RNA。

　　1.1.3. cDNA擴(kuò)增

　　反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，有多種策略合成第二條cDNA鏈

　　一種是SMART技術(shù)(switching mechanism at 5' end of RNA template)

　　這個(gè)系列包括Smart-seq，Smart-seq2，STRT，利用轉(zhuǎn)移酶和小鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶來(lái)進(jìn)行鏈置換并加上后續(xù)PCR擴(kuò)增的接頭。

　　PCR是常用的指數(shù)擴(kuò)增技術(shù)，很容易因?yàn)镚C含量的差異造成擴(kuò)增偏倚。

　　另一種就利用了體外轉(zhuǎn)錄的方式(IVT)進(jìn)行線性擴(kuò)增

　　這個(gè)系列包括CEL-seq，MARS-seq，CEL-seq2，通過(guò)將T7啟動(dòng)子連在oligodT引物上，可以在cDNA合成后啟動(dòng)IVT。IVT取消了對(duì)模板置換的需求。

　　另外，MALBAC-RNA使用準(zhǔn)線性擴(kuò)增，它的引物能生成末端互補(bǔ)的擴(kuò)增子，形成閉環(huán)來(lái)防止指數(shù)復(fù)制。

　　1.1.4. 方法選擇以及測(cè)多少細(xì)胞

　　不同的技術(shù)流程按照cDNA覆蓋大致可以分為兩類：全長(zhǎng)(full-length)和基于標(biāo)簽(tag-based)。

　　全長(zhǎng)的方法試圖得到基因體均勻讀長(zhǎng)覆蓋并增加匹配序列數(shù)，更適合亞型發(fā)現(xiàn)、剪切事件、SNP鑒定等等分析。一大缺陷是建庫(kù)通量較低，難以混樣測(cè)序。更重要的是，它不能結(jié)合UMIs(unique molecule identifiers)來(lái)進(jìn)行數(shù)字量化。有一個(gè)例外，MATQ-seq可以把barcodes和UMIs整合到MALBAC引物上，從而克服這個(gè)缺陷。

　　基于標(biāo)簽的方法可以繼續(xù)細(xì)分成5'還是3'，主要優(yōu)點(diǎn)是能結(jié)合UMIs，可以混合多個(gè)樣品，允許基因水平的定量?jī)?yōu)化。因?yàn)樽x長(zhǎng)被限制在序列一端，相對(duì)而言靈敏度較低，大部分僅用于基因表達(dá)定量。

　　選擇什么方法取決于要回答的生物學(xué)問(wèn)題。如果是發(fā)現(xiàn)細(xì)胞類型和鑒別組織成分，兩種方法都可以。基于標(biāo)簽的方法可以在反轉(zhuǎn)錄之后把所有樣品混在一起，價(jià)格更便宜規(guī)模可以更大。如果是等位基因表達(dá)、不同亞型的發(fā)現(xiàn)，全長(zhǎng)的方法更加合適。這些方法中，Smart-seq2在靈敏度和產(chǎn)量上都表現(xiàn)出眾，不過(guò)要用到Tn5，比較貴，如果有很多很多的細(xì)胞要測(cè)，比如4000個(gè)，那么Drop-seq也是很好的選擇。

　　關(guān)于靈敏度，需要考慮測(cè)序深度。這些方法都有一個(gè)共同點(diǎn)，當(dāng)一個(gè)樣品測(cè)到1M reads之后，靈敏度開(kāi)始變得比較穩(wěn)定，從1M reads 測(cè)到 4.5M reads，靈敏度只略微提升。

　　需要多少細(xì)胞的數(shù)據(jù)用來(lái)分析，取決于細(xì)胞類型的罕見(jiàn)程度。

　　Nicholas E. Navin提供了一個(gè)計(jì)算公式 P(d) =1-(1-s)^n

　　P(d):檢出能力(detection power) s：等同于亞克隆頻率(subclonal frequency) n：要測(cè)的細(xì)胞數(shù)

　　如果感興趣的細(xì)胞亞型占比約為1%，需要測(cè)250個(gè)細(xì)胞使檢出能力達(dá)到0.9，需要測(cè)500個(gè)細(xì)胞使檢出能力達(dá)到1.0。另外也需要做重復(fù)實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)估假陽(yáng)性率和假陰性率。

　　需要的細(xì)胞數(shù)和必要的測(cè)序深度同樣依賴于感興趣的細(xì)胞與其他細(xì)胞的差異程度，如果這種細(xì)胞有非常獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄特征，那么測(cè)的細(xì)胞數(shù)少一點(diǎn)，測(cè)序深度淺一點(diǎn)也是可以的。

　　1.1.5. scRNA-seq的技術(shù)挑戰(zhàn)

　　SingleCell的問(wèn)題：細(xì)胞與細(xì)胞之間有很強(qiáng)的異質(zhì)性。

　　只有一個(gè)細(xì)胞，初始數(shù)據(jù)量就小，噪音就大。

　　RNA捕獲效率不穩(wěn)定，文庫(kù)制備的隨機(jī)丟失會(huì)制造技術(shù)噪音。

　　隨機(jī)基因表達(dá)，不同的細(xì)胞狀態(tài)細(xì)胞大小細(xì)胞周期會(huì)產(chǎn)生生物噪音。

　　批次效應(yīng)使高通量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)存在系統(tǒng)誤差。

　　認(rèn)真規(guī)劃實(shí)驗(yàn)步驟，作多次生物學(xué)重復(fù)可以降低批次效應(yīng)，然而生物樣品的遺傳背景是很難通過(guò)實(shí)驗(yàn)步驟來(lái)控制的。

　　鑒定批次效應(yīng)的一個(gè)辦法是通過(guò)主成分分析(PCA)，看細(xì)胞是否會(huì)按照相應(yīng)的起源進(jìn)行分群。

　　為了解釋技術(shù)操作帶來(lái)的誤差，通常加入外源的RNA進(jìn)行質(zhì)控。不同濃度、長(zhǎng)度、GC含量的合成RNA可以起到監(jiān)控作用。

　　但是外源樣品與內(nèi)源RNA的分子特征并不會(huì)完全相同，對(duì)照作用有限。

　　怎么減少RNA損失，使信息能夠保真是scRNA-seq的關(guān)鍵性挑戰(zhàn)，測(cè)序結(jié)果仍需要謹(jǐn)慎對(duì)待，推薦做功能性驗(yàn)證。

　　1.2. 應(yīng)用

　　過(guò)去幾年，scRNA-seq已被應(yīng)用于發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞類型，探索動(dòng)態(tài)發(fā)育過(guò)程，鑒定基因調(diào)控機(jī)制，揭示隨機(jī)等位基因表達(dá)。

　　這篇綜述只著重介紹了胚胎植入前發(fā)育和大腦皮層，在這兩個(gè)方向上scRNA-seq有了巨大的概念性發(fā)展。

　　1.2.1. 胚胎植入前發(fā)育

　　生命起源于一個(gè)受精卵，受精卵的分化過(guò)程受轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控形成三個(gè)主要的細(xì)胞譜系。這個(gè)過(guò)程里有幾個(gè)長(zhǎng)期存在的問(wèn)題：1. 單個(gè)卵裂球之間是何時(shí)出現(xiàn)差異的?2. 三個(gè)細(xì)胞譜系如何及時(shí)分離?3. 胚胎基因組是何時(shí)激活的?4. 早期的規(guī)范化事件是否存在物種間差異?

　　scRNA-seq為這些問(wèn)題的解答提供了新的思路。早先對(duì)小鼠胚胎的早期卵裂球進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作(包括增、減單個(gè)細(xì)胞)，都不會(huì)影響到胚胎發(fā)育，表明早期卵裂球會(huì)經(jīng)歷一個(gè)調(diào)節(jié)發(fā)育(受到感應(yīng)信號(hào)可以變成任何細(xì)胞類型)。然而scRNA-seq的結(jié)果顯示，早在四分體時(shí)期，卵裂球間已經(jīng)存在分子不對(duì)稱了。后來(lái)通過(guò)比較滋養(yǎng)外胚層(TE)和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)的細(xì)胞命運(yùn)，鑒定出Sox21基因在四分體時(shí)期存在穩(wěn)定的異質(zhì)表達(dá)，并且影響后代細(xì)胞的分化路線。在植入前發(fā)育的各個(gè)階段，通過(guò)scRNA-seq可以得到一個(gè)全過(guò)程的基因動(dòng)態(tài)表達(dá)視圖，跨物種數(shù)據(jù)比較發(fā)現(xiàn)人和小鼠的胚胎發(fā)育存在很多的生物學(xué)差異，如胚胎基因激活時(shí)間，細(xì)胞譜系建立時(shí)期，等位基因特異性表達(dá)情況等等。對(duì)人類胚胎細(xì)胞進(jìn)行具體的功能研究比較困難，后面換成了相近的獼猴細(xì)胞。

　　1.2.2. 小鼠大腦皮層

　　在神經(jīng)系統(tǒng)科學(xué)領(lǐng)域，對(duì)所有哺乳動(dòng)物的神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行系統(tǒng)性分類是一個(gè)長(zhǎng)期的目標(biāo)。理解大腦的細(xì)胞構(gòu)成有助于破譯它的功能和連接性。不同的研究表明，對(duì)來(lái)自小鼠大腦不同區(qū)域的細(xì)胞做scRNA-seq，進(jìn)行細(xì)胞分群，發(fā)現(xiàn)中間神經(jīng)元具有更大的異質(zhì)性，暗示中間神經(jīng)元細(xì)胞具備更加復(fù)雜多樣的功能。通過(guò)基因表達(dá)譜得到的細(xì)胞類型分類是否顯著關(guān)聯(lián)不同的功能性質(zhì)還有待進(jìn)一步的研究，這些實(shí)驗(yàn)的方法都顯示有一定的偏好性。

　　為了讓基因表達(dá)直接關(guān)聯(lián)解剖、形態(tài)、功能的屬性，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)開(kāi)發(fā)出了Patch-seq，這個(gè)技術(shù)把全細(xì)胞電生理膜片鉗記錄與scRNA-seq相結(jié)合。

　　其中一個(gè)實(shí)驗(yàn)室結(jié)合膜片鉗和Smart-seq2，在新皮質(zhì)L1外層分析了58個(gè)皮層細(xì)胞，這項(xiàng)研究首次使用了機(jī)器學(xué)習(xí)以不同的放電模式來(lái)進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)分類，結(jié)果跟來(lái)自基因表達(dá)譜的分群結(jié)果對(duì)應(yīng)的很好。58個(gè)細(xì)胞分出兩種細(xì)胞亞型，eNGCs和SBCs，重要的是，發(fā)現(xiàn)SBCs富集了四個(gè)神經(jīng)精神病相關(guān)的基因。

　　另一項(xiàng)研究使用膜片鉗和STRT-seq，在軀體感覺(jué)皮質(zhì)的1/2層分析了45個(gè)中間神經(jīng)元和38個(gè)椎體神經(jīng)元細(xì)胞，根據(jù)電生理性質(zhì)和形態(tài)，分為5個(gè)亞型和3個(gè)亞型。這八個(gè)亞型跟scRNA-seq鑒定到的分群結(jié)果相吻合，從而確認(rèn)了Patch-seq方法的有效性。

　　Patch-seq的分析適用于離子通道和受體基因研究，可以預(yù)測(cè)神經(jīng)生理學(xué)表型。跟鮮活細(xì)胞的scRNA-seq相比，Patch-seq捕獲到的基因顯然更少，通量相對(duì)更低，然而正因?yàn)橛胁煌膯渭?xì)胞測(cè)序方法，使得從單細(xì)胞尺度上深入分析分子特征、形態(tài)和異常復(fù)雜組織的功能成為可能。

　　1.3. 未來(lái)展望

　　1.3.1. 空間轉(zhuǎn)錄組

　　單分子原位熒光雜交技術(shù)(smFISH)在2008年被開(kāi)發(fā)出來(lái)，用作單細(xì)胞尺度的組織RNA定量，它使用帶熒光基團(tuán)的20bp核酸探針。這項(xiàng)技術(shù)最初高度受限于能夠同時(shí)檢測(cè)到的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量，后來(lái)引入分組探針文庫(kù)的組合標(biāo)簽克服了這一缺陷。隨著七種光轉(zhuǎn)換染料和空間條碼結(jié)合超分辨顯微技術(shù)的使用，能夠同時(shí)檢測(cè)到的基因數(shù)進(jìn)一步增加。高分辨率的顯微鏡能夠識(shí)別結(jié)合了同一種探針實(shí)際序列不同的mRNA。接著，通過(guò)使用順序輪的雜交、成像、探針剝離來(lái)給mRNA加條碼，繼續(xù)優(yōu)化了該方法。smFISH的一大優(yōu)勢(shì)是雜交效率很高，能夠檢測(cè)到95%的mRNA。smFISH適用于剪切變異、染色體位點(diǎn)以及SNP。類似的，熒光原位RNA測(cè)序(FISSEQ)也使用基因特異的探針來(lái)讀取空間基因表達(dá)。跟smFISH明顯不同的是，F(xiàn)ISSEQ的reads比RNA-seq還少很多，豐度不夠。總體上看，以上這些原位熒光的方法想要覆蓋整個(gè)轉(zhuǎn)錄組，都比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力。

　　使用LCM的單細(xì)胞空間轉(zhuǎn)錄組方法已經(jīng)被開(kāi)發(fā)出來(lái)了。LCM可以從速凍組織切片中仔細(xì)分離出單個(gè)細(xì)胞，分辨率能達(dá)到亞細(xì)胞水平。LCM適用于任何胚胎和成熟時(shí)期，特別是那些難以分離的組織。通過(guò)簡(jiǎn)單的組織染色或者快速的抗體染色可以鑒定出感興趣的細(xì)胞。LCM最初是與全轉(zhuǎn)錄組基因芯片結(jié)合，然后是RNA-seq，直到現(xiàn)在，需要的細(xì)胞數(shù)也是數(shù)百上千。結(jié)合scRNA-seq和LCM的LCM-seq，通過(guò)直接裂解分離的細(xì)胞，消除通常是在LCM之后的RNA隔離步驟，可以簡(jiǎn)化流程，降低技術(shù)噪音，減少費(fèi)用。同時(shí)每個(gè)細(xì)胞的空間信息都保留了下來(lái)并且不需要組織分離步驟，從而能夠在單細(xì)胞水平同時(shí)研究細(xì)胞異質(zhì)性和空間差異。保留空間信息的重要性不應(yīng)該被低估它可能是組織內(nèi)細(xì)胞識(shí)別的關(guān)鍵性因素。此外，因?yàn)榧?xì)胞在分離前保留了原有位置的連接信息，比起需要進(jìn)行組織裂解的測(cè)序方法，更能夠反映生物體內(nèi)的真實(shí)情況。LCM-seq另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是可以用于缺損和部分退化的組織。然而，至今為止的一大缺陷是RNA有一些片段化，即使處理的時(shí)間很短也一樣，所以覆蓋度比起鮮活細(xì)胞要低，不能作RNA剪切的深入分析。LCM染色的后續(xù)優(yōu)化有可能克服這一障礙。

　　一種叫作”空間轉(zhuǎn)錄組(spatial transcriptomics)“的優(yōu)雅方法近期被開(kāi)發(fā)出來(lái)，能夠不分離細(xì)胞直接使用完整的組織切片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。組織切片被放置在slide上，使用含有獨(dú)特空間條碼標(biāo)記的反轉(zhuǎn)錄引物。 slide上布滿直徑100微米間隔200微米的孔，孔內(nèi)有接近兩億個(gè)寡核苷酸探針。組織經(jīng)過(guò)通透性處理后加上反轉(zhuǎn)錄試劑，組織最終會(huì)被酶解，留下cDNA與slide上排列的探針結(jié)合。這種方法的分辨率很高，100微米，對(duì)于整體空間信息的接收在時(shí)間上非常高效。但是不容易顯示出細(xì)胞的異質(zhì)性，因?yàn)榧?xì)胞大小的差異，這種方法只能展示出特定二維坐標(biāo)下單一或多個(gè)圖層的空間信息。

　　1.3.2. 單細(xì)胞多組學(xué)

　　測(cè)序技術(shù)目前已經(jīng)能夠從同一個(gè)細(xì)胞中獲取基因組、表觀組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白組的情況。因此，可以整合每個(gè)細(xì)胞的DNA、RNA、蛋白還有表觀修飾的信息得到一個(gè)綜合的理解。為了這個(gè)目的開(kāi)發(fā)的方法有：DR-seq和G&T-seq，同時(shí)分析基因組和轉(zhuǎn)錄組;scTrio-seq，基因組、轉(zhuǎn)錄組和甲基化譜;scM&T-seq，轉(zhuǎn)錄組和甲基化譜;PEA-qPCR，蛋白和一個(gè)基因panel。同時(shí)研究基因組和轉(zhuǎn)錄組可以在基因表達(dá)水平關(guān)聯(lián)CNV、染色體融合和調(diào)控因子的SNV。還可以揭示克隆結(jié)構(gòu)和細(xì)胞亞型，直接聯(lián)系基因型和表型。另一方面，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組和甲基化分析，可以知道單細(xì)胞中基因組不同功能因子的DNA甲基化水平與基因表達(dá)水平的關(guān)系。未來(lái)把總RNA，小RNA，染色體重組和高級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)合到單細(xì)胞多組學(xué)里，可以更加詳細(xì)的描述正常細(xì)胞功能和疾病過(guò)程。

　　另一個(gè)新興的前沿研究是結(jié)合系統(tǒng)基因功能分析和scRNA-seq分析。

　　1.3.3. 人類細(xì)胞圖譜和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)

　　2016年一群世界領(lǐng)先的科學(xué)家開(kāi)啟了人類細(xì)胞圖譜計(jì)劃(Human Cell Atlas)，目前已經(jīng)包括了免疫系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、上皮組織、胚胎細(xì)胞和癌癥。這個(gè)計(jì)劃將會(huì)提供一個(gè)囊括了細(xì)胞類型、標(biāo)記基因、信號(hào)通路和調(diào)控機(jī)制的綜合參考視圖，給不同個(gè)體和疾病的組織帶來(lái)更好的生物靶標(biāo)識(shí)別和藥物標(biāo)靶，從而進(jìn)一步發(fā)展精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)。

　　1.3.4. 把轉(zhuǎn)錄水平的差異關(guān)聯(lián)到細(xì)胞類型和功能

　　scRNA-seq的數(shù)據(jù)已經(jīng)表明，在大腦不同區(qū)域和不同的組織，細(xì)胞間的異質(zhì)性比之前預(yù)計(jì)的還要大。面前更艱巨的任務(wù)是從功能上評(píng)估RNA成分的異質(zhì)性具體在何種程度上影響了相關(guān)細(xì)胞表現(xiàn)出不同的功能。大部分的scRNA-seq研究對(duì)此有所描述，仍未清楚的是，多大程度的轉(zhuǎn)錄組差異會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞功能的區(qū)別，使細(xì)胞成為不同的類型而不是同類型細(xì)胞的不同可選狀態(tài)。某(幾)種轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量積累到什么水平能夠看到明顯的細(xì)胞功能改變?這取決于該基因的功能以及其他的基因表達(dá)，還取決于特定轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性和半衰期。不經(jīng)過(guò)功能測(cè)試就將功能與轉(zhuǎn)錄水平關(guān)聯(lián)起來(lái)不是一個(gè)簡(jiǎn)單的任務(wù)。無(wú)論如何，細(xì)胞和分子生物、生物化學(xué)、生理學(xué)以及數(shù)學(xué)模型的結(jié)合，將來(lái)肯定能夠解答革命性的scRNA-seq技術(shù)還不能回答的問(wèn)題。單細(xì)胞技術(shù)在未來(lái)的生物功能注釋中將會(huì)是不可或缺的工具。

　　1.4. 分析

　　這篇綜述沒(méi)有提到具體的數(shù)據(jù)分析。

　　(文章來(lái)源: 單細(xì)胞天地轉(zhuǎn)載僅供參考學(xué)習(xí)及傳遞有用信息，版權(quán)歸原作者所有，如侵犯權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系刪除)

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