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單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)及其在傳染病研究領(lǐng)域中的應(yīng)用
行業(yè)新聞 2018-11-13
　　同一組織中的細(xì)胞往往被認(rèn)為是具有相同狀態(tài)的功能單位，因此傳統(tǒng)的測(cè)序技術(shù)分析的是細(xì)胞群體的總體平均反應(yīng)。然而由于細(xì)胞存在異質(zhì)性，即使是來(lái)自同一細(xì)胞系或者相同細(xì)胞，由于基因組和表觀基因組的重編程(reprogramming)、DNA復(fù)制錯(cuò)誤等會(huì)產(chǎn)生不同的基因組、轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組。而單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)(single-cell sequencing，SCS)可以檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞DNA水平的單核苷酸變異(single nucleotide variations，SNVs)、拷貝數(shù)變化(copy number variatons，CNVs)和基因組結(jié)構(gòu)的變化，還可以檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞RNA水平的基因表達(dá)、基因融合和選擇性剪切等，以及DNA甲基化、組蛋白修飾等。近十年來(lái)，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)得到了迅猛的發(fā)展，已經(jīng)應(yīng)用在醫(yī)學(xué)、微生物學(xué)和免疫學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域。本文將對(duì)單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的方法和應(yīng)用進(jìn)行總結(jié)，并對(duì)其在傳染病研究中的應(yīng)用進(jìn)行介紹。

　　單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的方法

　　隨著測(cè)序技術(shù)的不斷創(chuàng)新，對(duì)細(xì)胞分子的研究逐漸從細(xì)胞群體發(fā)展到單個(gè)細(xì)胞樣本。早期使用低通量的免疫熒光、單細(xì)胞PCR(single-cell PCR)和單細(xì)胞實(shí)時(shí)PCR等技術(shù)檢測(cè)單細(xì)胞的分子標(biāo)記。下一代測(cè)序(next generation sequencing，NGS)技術(shù)的發(fā)展為實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)提供了新的可能。2009 年Tang等采用mRNA全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序法對(duì)小鼠單個(gè)四細(xì)胞期胚胎的卵裂球轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了單細(xì)胞水平分析。單細(xì)胞測(cè)序工作已經(jīng)迅速擴(kuò)展到整個(gè)基因組序列。

　　單細(xì)胞測(cè)序主要包括單細(xì)胞DNA測(cè)序、RNA測(cè)序和表觀基因組測(cè)序，這三種測(cè)序類(lèi)型可以從不同角度揭示細(xì)胞各個(gè)階段的功能和特點(diǎn)。其中表觀基因組測(cè)序可以揭示DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)可及性、蛋白質(zhì)-DNA相互作用和染色體的空間結(jié)構(gòu))等不同方面的基因調(diào)控。

　　單細(xì)胞測(cè)序主要包括以下4個(gè)步驟：?jiǎn)渭?xì)胞分離，核酸序列擴(kuò)增，基因測(cè)序和數(shù)據(jù)分析。其中單細(xì)胞分離方法和核酸序列擴(kuò)增策略是實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞測(cè)序的核心技術(shù)。

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)及其在傳染病研究領(lǐng)域中的應(yīng)用講解

　　單細(xì)胞分離

　　顯微操作法(micromanipulation)是比較普遍的直視分選細(xì)胞技術(shù)，成本低廉，但是通量低，需要投入大量人力，并且容易對(duì)細(xì)胞造成機(jī)械性損傷，不利于規(guī)?；瘧?yīng)用。而激光捕獲顯微切割技術(shù)(laser capture microdissection，LCM)可以快速獲取單個(gè)細(xì)胞，但是成本較高、通量低，并且該方法容易導(dǎo)致染色體片段丟失，還經(jīng)常造成RNA降解。

　　目前常用的單細(xì)胞分離技術(shù)是熒光激活細(xì)胞分選(fl uorescence-activated cell sorting，F(xiàn) ACS)。該方法與前述方法不同，可以高通量、自動(dòng)化地分離單個(gè)細(xì)胞，是目前應(yīng)用最多的單細(xì)胞分離技術(shù)。該方法通過(guò)細(xì)胞的物理特性(如細(xì)胞大小、熒光散射度)和特異性的分子標(biāo)記對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別和分離。FACS法需要大量的細(xì)胞懸液，并且該方法檢測(cè)的熒光信號(hào)強(qiáng)度有限，因此不適用于分選低豐度的細(xì)胞。

　　近幾年發(fā)展的微 流控技術(shù)(microfl uidics)利用微流控芯片上的微管道進(jìn)行多種單細(xì)胞分選。該方法需要的樣本量較少，試劑損耗低，細(xì)胞污染率低，可以進(jìn)行規(guī)?；耐茝V和應(yīng)用。因此，微流控技術(shù)是目前最理想的單細(xì)胞分離方法，具有廣闊的應(yīng)用前景。

　　核酸序列擴(kuò)增

　　與常規(guī)的群體細(xì)胞提取的核酸不同，單個(gè)細(xì)胞所含的DNA或RNA的含量?jī)H為皮克水平，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于任何測(cè)序技術(shù)所需的核酸量。因此通過(guò)全基因組擴(kuò)增(whole-genome amplifi cation，WGA) 和全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增(whole-transcriptome amplifi cation，WTA)，獲取高保真、無(wú)偏向性的足量DNA或RNA就成為單細(xì)胞測(cè)序的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

　　全基因組擴(kuò)增

　　在NGS技術(shù)之前，單細(xì)胞基因組擴(kuò)增多是基于PCR法， 如連接錨定PCR(l igation-anchored PCR，LA-PCR)、引物延伸與擴(kuò)增PCR(p rimer extension pre-amplifi cation PCR，PEP-PCR)和簡(jiǎn)并寡核苷酸引物PCR(d egeneration oligonucleotide primed PCR，DOP-PCR)。這些方法都存在擴(kuò)增效率低，且會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增的問(wèn)題?；诘葴胤磻?yīng)的多重置換法(multiple displacement amplifi cation，MDA)是常用的全基因組擴(kuò)增技術(shù)。MDA技術(shù)主要使用φ29DNA聚合酶，在恒溫下對(duì)DNA進(jìn)行高效的指數(shù)擴(kuò)增，獲得高保真、均一完整的全基因組序列。但是MDA技術(shù)會(huì)產(chǎn)生顯著的非特異性擴(kuò)增。而多重退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增法(multiple annealing and looping-based amplifi cation cycles，MALBAC)則采用線性擴(kuò)增方式，可獲得一致性好、偏倚少的全基因組DNA，顯著提高單細(xì)胞測(cè)序的精確度。MALBAC的擴(kuò)增效率相對(duì)MDA較低，也會(huì)產(chǎn)生較高的假陽(yáng)性率。

　　Stepanauskas等提出了一種組合MDA和FACS并改進(jìn)的方法，即WGA-X。該方法增強(qiáng)了單個(gè)微生物細(xì)胞和病毒顆粒的基因組回收效率，同時(shí)保持了易用性和可擴(kuò)展性，因此可以從未培養(yǎng)的微生物細(xì)胞和環(huán)境樣品中的病毒顆粒中獲得基因組序列和細(xì)胞大小信息。

　　全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增

　　單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增的方法主要有唐 氏法(Tang’s method)、Smart-seq、Smart-seq2、Quarz-seq、線性擴(kuò)法(c ell expression by liner amplification and sequencing，CEL-seq)，單細(xì)胞標(biāo)記的逆轉(zhuǎn)錄(s ingle-cell tagged reverse-transcription，STRT)和定量的單細(xì)胞RNA測(cè)序(q uantitative single-cell RNA-seq)等。其中Smart-seq 和Smart-seq2 通過(guò)模板轉(zhuǎn)換技術(shù)，能夠獲得全長(zhǎng)的RNA，不僅可以檢測(cè)基因表達(dá)情況，還可以研究單個(gè)細(xì)胞的選擇性剪切，鑒定新的轉(zhuǎn)錄本。

　　單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用

　　隨著單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展，該技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用在多個(gè)領(lǐng)域，如用于研究腫瘤的發(fā)生和演變、對(duì)腫瘤臨床檢測(cè)等。利用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)可以定量分析實(shí)體瘤和循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)的異質(zhì)性，檢測(cè)有重要作用的罕見(jiàn)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)克隆演變(clonal evolution)等。因此，可以利用該技術(shù)預(yù)測(cè)和監(jiān)控治療效果和預(yù)后情況、監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展、檢測(cè)耐藥等，實(shí)現(xiàn)個(gè)體化精準(zhǔn)醫(yī)療。例如Tirosh等利用單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)分析了4645 個(gè)轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性、腫瘤細(xì)胞分期和腫瘤微環(huán)境等。而Lohr等從多發(fā)性骨髓瘤病人中分離到335個(gè)腫瘤細(xì)胞，利用DNA測(cè)序技術(shù)監(jiān)測(cè)治療效果和基因突變。

　　此外，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)還應(yīng)用在胚胎學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)等多個(gè)方面，如病原微生物檢測(cè)、傳染病診斷、宿主免疫應(yīng)答、抗體篩選等等。下文將主要介紹單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在傳染病研究領(lǐng)域的應(yīng)用。

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)及其在傳染病研究領(lǐng)域中的應(yīng)用講解

　　單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在傳染病研究領(lǐng)域的應(yīng)用

　　利用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)，可以研究單細(xì)胞水平上病原微生物和宿主細(xì)胞的基因組或轉(zhuǎn)錄組。通過(guò)分析病原微生物的核酸序列，可以檢測(cè)和鑒定新的微生物物種，了解微生物的分子進(jìn)化機(jī)制，研究病毒感染的動(dòng)力學(xué);而通過(guò)分析宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，可以探討細(xì)胞異質(zhì)性對(duì)病毒生命周期的影響，以及病毒引起的宿主免疫應(yīng)答。

　　在微生物檢測(cè)進(jìn)化及傳染病診斷方面的應(yīng)用

　　單細(xì) 胞測(cè)序技術(shù)之前，由于很多微生物難以培養(yǎng)，科學(xué)家們無(wú)法破譯其基因組結(jié)構(gòu)。微生物的單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)可用于研究未培養(yǎng)微生物的代謝潛力、相互作用和進(jìn)化情況，發(fā)現(xiàn)新的微生物物種，大大促進(jìn)人類(lèi)微生物組計(jì)劃的發(fā)展。利用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)不僅可以檢測(cè)未知的病原微生物，還可以監(jiān)測(cè)到耐藥株的出現(xiàn)，跟蹤病原體的抗性，從而進(jìn)行傳染病的診斷。單細(xì)胞基因組學(xué)在傳染病領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，如單個(gè)細(xì)胞中的病毒感染動(dòng)力學(xué)，病原體的抗性和傳播跟蹤，靶向或非靶向的病原基因組的恢復(fù)，致病新病原菌鑒定等。

　　鑒于細(xì)胞異質(zhì)性的存在，在單細(xì)胞水平上理解病毒的遺傳結(jié)構(gòu)是至關(guān)重要的。Combe等對(duì)水泡性口炎病毒感染的90個(gè)單細(xì)胞的881個(gè)病毒斑進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)單個(gè)感染單元內(nèi)存在多個(gè)基因差異的病毒基因組。Guo等開(kāi)發(fā)了一種基于微流控技術(shù)的高通量平臺(tái)，用于分析單細(xì)胞中病毒感染的動(dòng)力學(xué)。他們已研究了達(dá)千個(gè)脊髓灰質(zhì)炎病毒感染的單個(gè)細(xì)胞，分析了其病毒感染的動(dòng)力學(xué)，發(fā)現(xiàn)抗病毒藥物可以選擇性地消滅病毒種群中的成員。這促進(jìn)了毒力因子的發(fā)現(xiàn)和特性鑒定，闡明了病毒種群逃避藥物的作用機(jī)制。Yang 等]調(diào)查了乙肝病毒感染情況，并在單細(xì)胞水平上量化了胞內(nèi)病毒核酸的數(shù)量，即細(xì)胞質(zhì)vRNA和vDNA，以及核共價(jià)封閉的環(huán)狀DNA(covalently-closed circular DNAs，cccDNAs)。

　　利用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)不僅可以精細(xì)化識(shí)別微生物基因組變異，進(jìn)行病原微生物進(jìn)化及溯源研究，還可以在單細(xì)胞水平上研究病毒感染的動(dòng)力學(xué)，定義病原微生物的代謝特征、致病潛力和耐藥性，進(jìn)行疾病診斷。這有助于闡明病原微生物與宿主之間的相互作用機(jī)制，會(huì)對(duì)傳染病防控和人類(lèi)健康領(lǐng)域帶來(lái)重要影響。

　　在宿主免疫應(yīng)答方面的應(yīng)用

　　宿主對(duì)病原微生物的免疫應(yīng)答研究通常是針對(duì)群體細(xì)胞。然而，這種群體細(xì)胞研究難以區(qū)分大細(xì)胞群體的弱反應(yīng)和小細(xì)胞群體的強(qiáng)反應(yīng);即使同源細(xì)胞也存在功能上的異質(zhì)性。單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)可以獲得宿主應(yīng)答的內(nèi)在異質(zhì)性，精準(zhǔn)評(píng)估免疫細(xì)胞被激活的分子機(jī)制。目前單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用在鑒定罕見(jiàn)的T細(xì)胞，分析細(xì)胞黏附分子，研究固有淋巴細(xì)胞的異質(zhì)性，篩選中和性抗體等。Holt等利用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)鑒定了罕見(jiàn)的CD4陽(yáng)性的T細(xì)胞。Yu 等利用單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)對(duì)小鼠骨髓祖細(xì)胞進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了固有淋巴細(xì)胞ILC2發(fā)育早期的免疫檢查點(diǎn)PD-1hiIL-25Rhi，從新的角度剖析PD-1和PD-L1在免疫治療中的作用。Tanaka等[33]針對(duì)人類(lèi)T淋巴細(xì)胞白血病病毒1 型(human T-cell lymphotropic virus type 1，HTLV-1)特異的CTL細(xì)胞的T細(xì)胞受體庫(kù)進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，發(fā)現(xiàn)移植前后骨髓和外周血CTL細(xì)胞的寡克隆多樣性受到高度限制。

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)及其在傳染病研究領(lǐng)域中的應(yīng)用講解
　　在抗體篩選中的應(yīng)用

　　目前大規(guī)模篩選抗體的方法主要是通過(guò)噬菌體、酵母等抗體文庫(kù)。所獲取的抗體存在一定的弊端：抗體是重鏈和輕鏈的隨機(jī)配對(duì)，掩蓋了自然的體液免疫反應(yīng);需要進(jìn)行大量的實(shí)驗(yàn);篩選出的中和抗體往往只具有有限的中和功能。

　　而單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)給抗體篩選帶來(lái)了重大變革。利用該技術(shù)可以從病人外周血淋巴細(xì)胞中獲得抗原特異性的單個(gè)記憶性B細(xì)胞，并針對(duì)單個(gè)細(xì)胞的抗體的重鏈 和輕鏈進(jìn)行RT-PCR，從而獲得人源的單克隆抗體。單個(gè) B細(xì)胞測(cè)序技術(shù)可以快速、高效地分離鑒定出抗原特異性的中和抗體，具有廣闊的應(yīng)用前景。

　　目前，利用單個(gè)B細(xì)胞測(cè)序技術(shù)已經(jīng)篩選和鑒定出多種病毒的中和抗體。Scheid等利用FACS法從感染艾滋病毒的患者中分離到對(duì)HIV抗原有親和力的記憶性B細(xì)胞，并從中篩選到大量的HIV-1特異性的中和抗體。Tsioris等通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)從人B細(xì)胞中鑒定出針對(duì)西尼羅河病毒的中和抗體。Wang等從中國(guó)寨卡康復(fù)病人體內(nèi)鑒定出高效、特異的寨卡病毒單克隆抗體。該抗體能在小鼠模型上有效治療寨卡病毒感染，有望成為治療寨卡病毒感染的候選藥物。類(lèi)似地，Cox 等從人抗原特異性記憶B細(xì)胞中篩選到登革病毒的中和抗體。

　　單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)是生物學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)里程碑。經(jīng)過(guò)近幾年的發(fā)展，該技術(shù)已經(jīng)大量應(yīng)用在腫瘤研究、臨床檢測(cè)、免疫應(yīng)答、抗體篩選和微生物鑒定等各個(gè)領(lǐng)域。該技術(shù)不僅可以對(duì)未培養(yǎng)的病原微生物直接測(cè)序，還可以快速、高效地篩選出抗原特異的人源中和抗體，以應(yīng)對(duì)新發(fā)和突發(fā)的傳染性疾病。

　　但是該技術(shù)仍處在不斷完善和發(fā)展的階段，還存在以下方面亟需改進(jìn)：①在前期細(xì)胞樣本的采集和保存階段，務(wù)必要保證細(xì)胞樣本新鮮，或者加入有效的保護(hù)劑;②單細(xì)胞分選時(shí)還可能存在細(xì)胞交叉污染、細(xì)胞損傷等問(wèn)題，期望未來(lái)微流控芯片技術(shù)能夠不斷改進(jìn)，大大提高單細(xì)胞分選的效率;③DNA或RNA擴(kuò)增中仍然存在擴(kuò)增失敗，或者產(chǎn)生很多非特異性產(chǎn)物情況，需要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，同時(shí)也期待擴(kuò)增技術(shù)的不斷改進(jìn)。此外，使用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的成本仍然很高，影響了其在臨床檢測(cè)的應(yīng)用和推廣。

　　隨著單細(xì)胞多組學(xué)測(cè)序技術(shù)(single-cell multiomics sequencing)的發(fā)展，未來(lái)有望利用該技術(shù)在單細(xì)胞水平進(jìn)行基因組、轉(zhuǎn)錄組、表觀基因組和蛋白質(zhì)組等多種組學(xué)的綜合研究，從而更加系統(tǒng)全面地分析單個(gè)細(xì)胞、細(xì)菌或病毒的功能，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療，加強(qiáng)傳染病防控。



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