實(shí)體組織單細(xì)胞懸液制備有哪幾種方法?
(1)單細(xì)胞懸液制備機(jī)械法：
1)用剪刀剪碎或者用鋒利的解剖刀剁碎組織;
2)將剪碎的組織加入勻漿器中勻漿;
3)用吸管或注射器抽吸細(xì)胞懸液，以分散細(xì)胞;
將細(xì)胞懸液在尼龍網(wǎng)或不銹鋼網(wǎng)上過濾，濾出的細(xì)胞懸液細(xì)胞計(jì)數(shù)后即可使用。
(2)單細(xì)胞懸液制備酶處理法：
此法是實(shí)體組織分散為單個(gè)細(xì)胞的主要方法。由于不同酶對(duì)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間不同組分有特異消化作用，所以應(yīng)根據(jù)所用組織類型確定使用酶的種類。此外，乙二胺四乙酸(EDTA)能結(jié)合組織中的二價(jià)鈣離子和鎂離子，而二價(jià)鈣離子和鎂離子有維持細(xì)胞表面完整性和維持細(xì)胞間質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用，因此，幾種酶和EDTA聯(lián)合使用有助于充分消化實(shí)體組織，提高細(xì)胞產(chǎn)出效率。下面僅介紹組織消化的一般過程，對(duì)于每種組織消化時(shí)所用的具體步驟需參考該組織細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的消化方法。
1)將組織剪成l～2mm3左右的小塊。
2)用胰蛋白酶或膠原酶消化組織塊，胰蛋白酶適用于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織，如胚胎、上皮、肝、腎等組織。胰蛋白酶工作濃度一般為0.1%～0.5%。對(duì)于纖維較多的組織或較硬的癌組織常用0.25%膠原酶，膠原酶對(duì)組織中膠原蛋白類結(jié)構(gòu)消化作用強(qiáng)，它僅對(duì)細(xì)胞間質(zhì)有消化作用而對(duì)上皮細(xì)胞影響不大。膠原酶常用劑量為0.1～0.3ug/m1。用大于組織量30～50倍的胰蛋白酶液或膠原酶液在37℃條件下消化組織，需每隔一定時(shí)間搖動(dòng)一次。消化時(shí)間的長短依組織類型而定，一般來說，胰蛋白酶需作用20～60分鐘，膠原酶需4～48小時(shí)。在消化過程中，如發(fā)現(xiàn)組織塊已分散而失去塊的形狀，經(jīng)搖動(dòng)即可成為絮狀懸液，則可取出少量液體在顯微鏡下觀察，可見分散的單個(gè)細(xì)胞和少量的細(xì)胞團(tuán)，可認(rèn)為組織已消化充分。
3)消化完畢后，將細(xì)胞懸液通過100目孔徑尼龍網(wǎng)或不銹鋼網(wǎng)濾過，以除掉未充分消化的組織。
4)已過濾的細(xì)胞懸液經(jīng)800～1000rpm低速離心5～10分鐘后，棄上清液，加PBS液，輕輕吹打形成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后即可使用。
3.石蠟包埋組織的流式細(xì)胞樣品制備 外科手術(shù)獲得的新鮮實(shí)體組織，往往已進(jìn)行石蠟包埋處理，如果再制成細(xì)胞懸液(單細(xì)胞懸液制備)進(jìn)行流式細(xì)胞分析，需將石蠟包埋組織進(jìn)行以下步驟的處理：
(1)將石蠟包埋的組織塊切成30/xm厚的切片，盡可能除去切片中石蠟成分;
(2)將切片置于離心管中，用二甲苯脫蠟2次，10分鐘/次;
(3)蒸餾水洗2次后，加入lml l%胃蛋白酶溶液中(pH 1.5)，37℃恒溫振蕩水浴中消化30分鐘;
(4)離心，所獲得的細(xì)胞沉淀可進(jìn)行染色和流式細(xì)胞術(shù)分析。
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